背景
先天性心臟病兒童存在神經發育不良的風險。 腸道微生物組可能通過腸腦軸影響神經發育結果。 本研究調查了早期腸道微生物組與神經發育結果的關聯。
方法
在心臟重症監護室進行了一項前瞻性佇列研究。 在手術前、手術后和出院前收集糞便樣本。 使用貝利嬰兒和幼兒發展量表在9-12個月進行神經發育測試。 對16S核糖體RNA V4區域的微生物數據進行處理。 使用Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2和MicrobiomeAnalyst 2.0分析微生物組數據。
結果
分析了24名患者：15名（62.5%）為男性，12名（50%）為白人。 認知能力（Chao1 P = 0.024）和語言評分（Chao1 P = 0.018）較低的兒童α多樣性較低; β多樣性顯示邊緣顯著差異（Jaccard P = 0.102和P = 0.051）。 較低的認知評分與較少的副擬桿菌屬（Parabacteroides）（P = 0.031）、擬桿菌屬（Bacteroides）（P = 0.041）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）（P = 0.047）相關; 較低的語言評分與較少的雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）（P = 0.044）和腸球菌屬（Enterococcus）（P = 0.024）相關。 較低的運動評分與較少的羅氏菌屬（Rothia）（P = 0.017）相關，但與更高的沙雷氏菌屬（Serratia）（P < 0.001）、不動桿菌屬（Acinetobacter）（P = 0.016）和變形桿菌屬（Proteus）（P = 0.013）豐度相關。
結論
先天性心臟病且認知和語言評分較低的兒童α多樣性較低且抗炎菌群（如雙歧桿菌屬）較少，而運動評分較低的兒童則有更高豐度的促炎菌群（如沙雷氏菌屬、不動桿菌屬和變形桿菌屬）。 需要進一步研究以了解腸道微生物失調對先天性心臟病兒童神經發育的縱向影響。
引言
先天性心臟病是最常見的出生缺陷，約佔所有出生的1%，其中約25%將在新生兒期需要手術。 心臟護理的快速進展顯著提高了存活率。 然而，先天性心臟病的存活者面臨各種合併症，包括神經發育問題（如認知功能、語言和運動發展）。 約50%的先天性心臟病兒童也存在神經發育障礙。 美國心臟協會關於先天性心臟病患者預後的聲明將神經發育延遲視為影響這些兒童生活品質的最重要合併症之一。 目前仍存在一個缺口，即識別有助於神經發育監測和管理的因素，最終改善先天性心臟病存活者的長期生活品質。
腸腦軸是腸道與大腦之間的一個雙向通信網路，是研究腸道微生物組在神經發育障礙中作用的有前景領域。 同時，腸道微生物組對先天性心臟病兒童的影響是一個日益增長的研究興趣領域。 腸道微生物組由生活在人體胃腸道中的全部微生物組成，與宿主表現出複雜的相互作用，並可能通過腸腦軸影響神經發育。 該軸通過神經遞質、代謝物和免疫信號促進腸道微生物群與中樞神經系統之間的通信。 因此，腸腦軸的破壞可能導致能量獲取、炎症和短鏈脂肪酸產生的改變，進而可能導致先天性心臟病兒童的神經發育延遲。 先天性心臟病嬰兒由於早期接觸心臟手術、抗生素以及口咽、胃和腸道中的氣管插管和餵養管，特別容易受到腸道微生物組失調的影響。
儘管新興文獻支援先天性心臟病兒童腸道微生物組失調的發現，但大部分
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工作集中在圍手術期。 早期腸道微生物組對兒童神經發育的長期影響尚未得到研究。 此外，現有文獻開始支援早期腸道微生物組在健康幼兒神經發育中的作用。 然而，腸道微生物組與先天性心臟病嬰兒神經發育結果之間的關聯仍不明確。 本研究的目的是描述先天性心臟病嬰兒腸道微生物組與神經發育結果（即認知功能、語言和運動發展）之間的關聯。 我們假設腸道微生物組失調與先天性心臟病嬰兒的神經發育評分降低相關。 具體而言，我們還假設較低的相對α和β多樣性與先天性心臟病嬰兒的神經發育評分降低相關。 此外，我們假設有益菌群（如雙歧桿菌屬）的相對豐度較低與先天性心臟病嬰兒的神經發育評分降低相關。 本研究的主要結果是確定腸道微生物失調與神經發育評分的關聯。
材料與方法
設計
我們於2021年至2023年在亞特蘭大兒童醫療保健中心對24名先天性心臟病嬰兒進行了一項前瞻性佇列研究。 本研究根據赫爾辛基宣言的指南進行。 所有涉及人類參與者的程式均獲得機構審查委員會（STUDY0000264（2））的批准。 在獲得父母或監護人的書面知情同意後收集樣本。 我們的主要結果是確定腸道微生物失調與不良神經發育評分的關聯。 失調定義為較低的α多樣性、較低的β多樣性或有益菌群的喪失; 較低的神經發育評分是通過比較貝利測試低於平均水準與高於平均水準的腸道微生物組來衡量的。
參與者和環境
納入2021年至2023年在亞特蘭大兒童醫療保健中心心臟重症監護室住院的先天性心臟病新生兒。 符合條件的兒童在9至12個月期間進行了門診神經發育評估。 排除標準包括（1）由於迴腸切除術或結腸切除術導致短腸而無法耐受腸內餵養的嬰兒; （2）手術時早產<36周的嬰兒; （3）心臟手術后在心臟重症監護室以外的其他醫院單元恢復的嬰兒; 以及（4）在心臟重症監護室出院前死亡的嬰兒。
程式
在獲得同意後識別並納入符合條件的嬰兒。 數據記錄到REDCap中。 在住院期間三個時間點收集糞便樣本（手術前[T1]、手術后[T2]和出院前[T3]）。 使用人類微生物組專案建立的標準腸道微生物組數據收集程序作為協定。
測量
人口統計學和臨床因素
嬰兒的人口統計學數據，包括性別、年齡、診斷年齡以及種族和民族，由父母或法定監護人報告。 臨床變數包括診斷、手術程式和嬰兒健康史（如母親產前史、藥物、陰道分娩與剖宮產以及飲食組成[人乳、嬰兒配方奶或兩者]），這些數據由父母自我報告或從醫療記錄中收集。
腸道微生物組
在排便后，通過棉簽從參與者的尿布中收集三個糞便樣本：一個用於數據分析，一個用於品質控制，一個用於必要時存儲。 收集的糞便樣本在收集后4小時內轉移到大學實驗室，並儲存在-80°C的鎖定實驗室冷凍櫃中，直到分析。 所有收集的數據均匿名，並記錄在安全大學伺服器上密碼保護檔中的安全電子表格中。 樣本在住院期間的三個不同時間點（T1、T2和T3）收集。 詳細方法已在我們之前的工作中發表。
神經發育測試
根據常規術后門診護理和第一年內的最佳實踐建議，進行認知功能、語言和運動發展的標準化測試。 發育評估由一位在先天性心臟病術后兒童護理方面有經驗的訓練有素的兒童心理學家使用貝利嬰兒和幼兒發展量表（貝利）進行。 貝利用於檢測早期發育延遲，並已在臨床和研究環境中使用。 第四版於2019年出版，適用於1至42個月的兒童，測量五個領域的神經發育：認知、運動、語言、社會情感和適應行為。 分析中使用的領域基於可用數據，缺失數據的領域（如情感和適應行為）未進行分析。 共有29名患者符合條件，其中5名患者缺少貝利評分，留下24名進行分析。 貝利量表的平均綜合評分為100。 由於樣本量小，患者被分為認知、語言和運動評分低於平均分的患者與那些達到或高於這些維度平均分的患者，並作為二元結果進行分析。
感興趣的暴露和結果
我們感興趣的暴露是腸道微生物失調對神經發育結果的影響。 腸道微生物失調定義為較低的相對α多樣性、較低的相對β多樣性或有益菌群的相對豐度較低。 患者被分為貝利評分低於平均分的認知、語言和運動發展患者與達到或高於認知、語言和運動評分平均分的患者。 然後我們調查了神經發育結果與腸道微生物失調（較低的相對α多樣性、較低的相對β多樣性和有益菌群的相對豐度較低）之間的關聯。
DNA提取和測序
腸道微生物組的細菌DNA提取和測序在加拿大溫哥華的Microbiome Insight進行，遵循人類微生物組項目標準操作協定。 本研究對16S核糖體RNA（16S rRNA）V4區域進行測序。 文庫製備、測序過程和測序數據的詳細資訊在先前出版物中提供。
統計分析
本研究分析了從更大父母佇列研究中獲得的既有腸道微生物組又有神經發育結果數據的兒童子集。 父母研究納入了41名先天性心臟病嬰兒，其人口統計學特徵如下：手術時平均年齡6.3天（SD = 8.0），58.5%為男性，53.7%為白人，95.1%為西班牙裔，51.2%為陰道分娩，31.7%為母乳餵養。 其中，24名兒童被納入當前分析，其人口統計學特徵與父母佇列相似。 基於神經發育評分，患者被分析為貝利評分低於平均水準與高於平均水準的患者。
使用Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2（QIIME 2）處理、過濾16S rRNA V4基因序列並聚類為計數數據。 在QIIME 2中，使用Divisive Amplicon Denoising Algorithm 2進行序列品質控制（例如修剪序列和過濾phiX讀數和嵌合序列）。 序列通過細菌分類學分析使用Silva v132資料庫進行過濾，閾值為99%。 使用條形圖說明時間點和神經發育結果的關鍵微生物。 使用相對豐度≥0.001和樣本流行率≥10%的閾值，進行核心微生物組分析以識別在時間點組成保持穩定的屬。 使用Spearman秩相關探索與神經發育結果相關的微生物模式。 核心微生物組和模式分析均使用MicrobiomeAnalyst 2.0完成。
使用QIIME 2和MicrobiomeAnalyst 2
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.0進行多樣性分析和豐度分析，以研究腸道微生物失調與神經發育結果之間的關聯。 使用觀察到的操作分類單元、Chao1和Shannon指數估計α多樣性（樣本內）。 進行Spearman相關分析以分析連續變數的α多樣性估計值，對分類變數使用Mann-Whitney U檢驗。 使用Bray-Curtis和Jaccard距離度量和主座標分析來可視化β多樣性（樣本間）的神經發育結果模式。 使用置換方差分析來測試β多樣性與神經發育結果之間的關聯。
線性判別分析效應大小是一種生物標誌物發現方法，可識別具有統計顯著性和生物學相關性的特徵。 具體而言，使用Kruskal-Wallis和秩檢驗檢測腸道微生物特徵，這些特徵在達到或高於與低於平均神經發育結果評分（即認知、語言和運動領域）的參與者之間顯示出顯著差異豐度。 隨後，應用線性判別分析效應大小來估計每個差異豐度特徵的效應大小，使用P < 0.05的顯著性閾值和2的線性判別分析分數（效應大小）閾值。 然後使用微生物組多變數關聯與線性模型2擬合一般線性模型，以檢查腸道微生物特徵與神經發育結果之間的關聯。 這些模型包括主要結果變數、協變數和阻斷因素。 在本研究中，微生物組多變數關聯與線性模型2識別了與神經發育結果相關的腸道微生物特徵（建模為固定效應），同時控制相關協變數（也建模為固定效應）。 協變數包括性別、種族、分娩方式、餵養類型和研究時間點，基於它們與腸道微生物組的顯著相關性進行選擇。 報告了未經調整的P值和使用Benjamini-Hochberg程式的錯誤發現率調整P值，邊際統計顯著性定義為P < 0.1，統計顯著性定義為P < 0.05
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