人體微生物組由存在於各種器官和組織內外的微生物群落組成，包括細菌、病毒和真菌。 僅細菌的總數（38萬億）就估計超過我們自身細胞的數量（30萬億）¹，²。 除了那些引發即時健康問題的微生物外，人們對這些微生物的關注一直較少。 然而，近年來，由於檢測技術的改進，人們開始關注身體特定器官和組織的微生物組，包括腸道³，⁴。 作為腸道一部分的人體結腸（大腸）是體內微生物組的最大貢獻者¹。 腸道微生物組最為多樣化，參與了廣泛的代謝過程，這些過程可能有益（包括促進脂肪儲存、血管生成、免疫訓練、維生素生物合成、藥物代謝以及複雜食物化合物的分解）⁴，⁵，也可能有害（菌群失調導致不同疾病狀態或直接引起感染），這取決於微生物的種類和/或豐度⁴，⁵。
早期研究報導，簡單碳水化合物，包括食糖（蔗糖）、果糖和乳糖，在攝入后不需要消化，而是在小腸上部被迅速吸收⁶。 然而，複雜碳水化合物，包括澱粉、纖維素和纖維，在胃中不易消化，可能會到達大腸，在吸收前由腸道微生物分泌的酶協助消化⁶。 此外，腸道微生物對不可消化纖維的發酵會產生短鏈脂肪酸，這些短鏈脂肪酸可被身體用作營養來源，並在肌肉功能和預防慢性疾病（包括某些癌症和腸道疾病）方面發揮重要作用⁶。 釋放的短鏈脂肪酸降低了結腸的pH值，這限制了能在結腸中生存的微生物範圍，限制了某些有害細菌（如艱難梭菌）的生長⁶。
與健康腸道相關的微生物群，包括普雷沃菌、瘤胃球菌、擬桿菌、厚壁菌、消化鏈球菌、雙歧桿菌和乳桿菌，它們在低氧環境中茁壯成長，通過爭奪營養和附著於腸道黏膜（免疫活動和抗菌蛋白產生的主要場所）的位點，來防止通過飲用或食用受污染的水或食物進入體內的有害細菌過度生長⁷⁻⁹。
已知直接影響腸道微生物組成和
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/或豐度的因素包括環境、出生方式、藥物使用、遺傳和飲食，這些因素造就了獨特的個體特異性微生物組³，¹⁰，¹¹。 然而，現在人們的注意力主要集中在飲食對塑造腸道微生物組的直接影響上，因為無論我們出生在哪裡或如何出生、健康與否，每個人都會進食⁶。 富含益生元如果聚寡糖、菊粉、果膠、抗性澱粉和樹膠的食物物質，包括水果、蔬菜、豆類和全穀物（如小麥、燕麥、小米和大麥），對腸道健康特別重要，因為它們作為有益微生物群的食物⁶，¹²。 然而，益生菌食品，包括發酵食品，如開菲爾、含活性菌種的優酪乳、泡菜蔬菜、天貝、康普茶、泡菜、味噌和酸菜，含有有益的活性微生物，可能會進一步改變微生物組¹³，¹⁴。
育齡婦女（WRA）是一個特殊群體，她們對營養素的需求很高¹⁵，尤其是在懷孕和哺乳期間。 生活在貧困社區的婦女特別容易營養不良，隨之而來的是健康問題¹⁵。 因此，通過可獲得的、營養豐富的食物來滿足這一群體婦女的營養需求，對改善孕產婦和兒童健康結果以及整體社區福祉具有重要意義。 然而，在經濟條件較差的社區中，很難滿足特定營養素的日常需求。 生活在貧困社區的婦女特別容易營養不良，隨之而來的是健康問題¹⁵。 布吉納法索（Burkina Faso）生產的發酵牛奶-小米飲料“德格”（degue）在迦納越來越受歡迎，已成為迦納城鄉居民快速獲取營養的來源。 這種產品通常因其原產地而被稱為「布吉納」（burkina）或「布魯基納」（brukina）。 然而，牛奶的高成本使該產品價格昂貴，貧困人群難以負擔。 此外，這種產品不適合乳糖不耐受者。 我們的研究旨在使用大豆（一種富含纖維、蛋白質、鎂、鐵和脂肪的廉價豆類）生產的牛奶替代牛奶來生產布吉納，並評估其對迦納育齡婦女腸道微生物組多樣性的潛在益處。 我們預計這種稱為大豆奶-布吉納（SMB）的發酵植物性奶產品將更便宜、更安全，並對消費者更有營養益處。 此外，與飼養牲畜獲取牛奶相比，大豆奶在布吉納生產中的使用對環境影響更小，最終將促進大豆市場的發展，而大豆市場正在大力推廣以改善迦納當地農民的生計。
方法
研究區域
本研究在迦納沃爾特地區的霍霍埃市（HMV/GH）進行。 根據迦納共和國財政部2024年報告：HMV/GH人口規模為114,472（2021年人口住房普查數據），其中男性54,893人（48%），女性59,579人（52%）。 與區域平均水準（每平方公里175人）相比，HMV/GH人口密度高（每平方公里312.3人），約73%的人口居住在城市地區，27%居住在農村地區。 該市平均家庭規模為3.1人，低於區域平均值3.3人和全國平均值3.6人。
倫理批准
研究方案和方法經迦納衛生服務倫理審查委員會（GHS-ERC 015/10/21）、科學與工業研究委員會機構審查委員會（CSIR/IRB/AL/VOL 1-017）和健康與 allied 科學大學研究倫理委員會（UHAS-REC A7 （2） 2t-22）審查和批准，以確保結果的完整性和保護參與者，符合《赫爾辛基宣言》。
納入和排除標準
納入15-49歲的育齡婦女，無論是否懷孕或哺乳，而年齡<15歲的女孩和年齡>49歲的婦女被排除在外。 在研究開始前至少一個月內服用抗生素或服用維生素礦物質補充劑的婦女也被排除在研究之外。
知情同意和參與者招募
在招募前，向所有願意參與的育齡婦女獲得知情同意（向所有育齡婦女宣讀，識字者簽名，不識字者按手印）。 對於18歲以下的婦女，在入組前還需獲得其本人同意以及法定監護人或父母的同意。 使用半結構化問卷收集招募的育齡婦女的人口統計學資訊。 本研究招募了40名參與者，包括10名哺乳母親、10名孕婦和20名非孕婦非哺乳（NPNL）婦女（表1）。 招募的育齡婦女被分為兩個飲食佇列，分別餵食大豆奶-布吉納（SMB）（5名哺乳母親、5名孕婦和10名既不懷孕也不哺乳的婦女）或大豆奶-小米混合飲料（5名哺乳婦女、5名孕婦和10名NPNL）。
大豆奶-布吉納（SMB）和大豆奶-小米混合飲料（SMMB）的生產
SMB和SMMB的製備原料包括大豆、珍珠小米、糖和適量鹽。
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生產包括四個不同階段：大豆奶生產、大豆奶發酵成優酪乳（用於SMB）、小米粉蒸煮以及將蒸煮后的小米粉與新鮮大豆奶或大豆優酪乳混合（補充圖1）。
大豆奶生產
大豆奶使用內部定製程序生產。 簡而言之，2千克整粒大豆在室溫（28°C）下用飲用水浸泡8小時。 隨後用電動研磨機將大豆與6升水一起研磨成糊狀。 再加入8升水，持續攪拌形成漿液。 然後將漿液在壓力鍋中以110°C和1巴壓力煮15分鐘。 過濾煮熟的漿液以提取12-15升大豆奶。 每升大豆奶添加45克糖和1克鹽以改善口感。 然後添加香草調味。 使用折射儀評估白利糖度，確保每輪生產的大豆奶具有最佳一致性。
大豆優酪乳生產
大豆優酪乳的製備方法與牛奶優酪乳基本相似。 從AECI食品與飲料公司（AECI Limited的子公司）採購了優酪乳 starter culture（YC-380，版本：5 PI EU EN 11-11-2019）。 以每升大豆奶0.1克的比例添加starter culture，並加熱至45°C並充分混合。 接種后的大豆奶在預設溫度45°C下培養8小時，製成“可飲用”的大豆優酪乳。
蒸小米凝集物生產
1千克小米洗凈並浸泡8小時。 然後瀝干、沖洗並研磨成粗粉。 將粗粉灑上水，用手掌揉搓形成生凝集物。 在中火上煮沸2升新鮮水。 將生凝集物加入沸水中，持續攪拌20分鐘，直至達到結塊和粘稠的質地。 將結塊的小米（蒸凝集物）從沸水中取出，在室溫下冷卻。
SMB和SMMB的配製
將1升大豆優酪乳測量到混合碗中。 加入600克蒸小米凝集物，用叉子搗碎結塊，然後舀入含有大豆優酪乳的混合碗中。 使用氣球攪拌器將大豆優酪乳和蒸小米碎屑充分混合，直至碎屑均勻分散在整個優酪乳中，形成SMB。 SMMB的配製遵循相同程式，用未發酵的大豆奶替代大豆優酪乳。 生產的SMB和SMMB在5°C下冷藏，直到準備食用。
參與者餵養和糞便樣本收集
這項單盲集群隨機對照試驗於2022年9月至11月進行。 集群是接收SMB或未發酵產品（稱為大豆奶-小米混合飲料，SMMB）的不同社區。 每名育齡婦女在直接觀察下每天餵食300毫升SMB或SMMB，持續八周，以確保依從性。 使用OMNIgene-gut（OM-200）樣本收集套件在基線（干預前第0周）、干預期間（第6周和第8周）和終點（干預后第10周和第12周）收集糞便樣本，並在-80°C下儲存，直到準備進行DNA提取和巨集基因組研究。 我們選擇這些干預前、干預中和干預后研究設計，以確保在干預前有明確的基線資訊，檢測干預的潛在影響，並檢測干預的影響是短暫的還是持續存在的。
糞便樣本DNA提取用於巨集基因組分析
在無菌條件下，讓冷凍樣本在室溫下解凍，然後使用DNeasy PowerSoil® Pro試劑盒（Qiagen，Hilden，德國）根據製造商的協議進行DNA提取。 簡而言之，將約1000 μL的每種液化糞便樣本添加到含有裂解緩衝液的Power Bead Pro管中，並在Bead Genie bead beater（Scientific Industries Inc.，紐約，美國）中以最大速度機械均質化5分鐘。 去除抑製劑后，DNA結合到固體介面進行洗滌。 然後洗脫純DNA，並使用NanoDrop 2000分光光度計（Thermo Scientific，Waltham，馬薩諸塞州）檢查其品質。 DNA樣本在-80°C下儲存，直到作為60 μL等分試樣在密封的96孔板中運送到美國明尼蘇達大學基因組中心（UMGC），用於16S rRNA V3/V4區域文庫製備和使用Illumina平臺的測序，遵循製造商的協定。
序列生物資訊學分析
使用fastp去除Illumina適配器序列並過濾低品質讀數，對解復用的配對端序列讀數進行修剪。 使用kraken2和標準32gb kraken微生物資料庫對過濾后的讀數進行各種分類群的分類分配。 將分類分配的相對豐度合併為單個.csv檔，導入R進行進一步分析。 將樣本元數據導入R並與合併的kraken2報告結合，使用R的phyloseq包生成系統發育序列（phyloseq）對象，用於下游分析。 使用R中實現的RStudio中的vegan包的rarefy_even_depth函數進行稀疏化（稀疏深度為1000，低於序列深度最小的樣本的深度）后，使用vegan包的多樣性函數生成特徵表和數據摘要，以確定每個樣本的序列分佈和使用R中實現的加權UniFrac度量的β-多樣性（兩個或多個樣本之間物種組成的差異）， 以及樣本的α-多樣性（樣本內微生物物種的多樣性）。
統計分析
在指定時間點，使用95%置信水準的Fisher精確檢驗和PERMANOVA分析進行兩組之間的α-多樣性和β-多樣性分析。 我們使用Bonferroni校正進行多次假設檢驗，以避免犯I類錯誤（拒絕真實的零假設）。 在alpha水準為0.05的情況下，哺乳母親和孕婦之間比較的調整p值≤0.01被認為具有顯著性，而非孕婦非哺乳婦女之間比較的調整p值≤0.005被認為具有顯著性。
結果
腸道微生物群的多樣性
腸道微生物群的Beta（β）-多樣性
我們使用加權UniFrac度量評估兩組之間的β-多樣性，該度量考慮了分類群的系統發育關係和相對豐度。 我們發現，通過主座標分析（PCoA）（圖1），ASV沒有按組特異性聚類。 PCoA圖將ASV投影到二維空間，點之間的距離反映了微生物組成的差異。 位置更近的樣本代表相似的微生物群落，而距離更遠的樣本具有更不相似的群落。 PERMANOVA分析證實，組間β-多樣性差異在統計學上不顯著（p=0.056），表明無論干預和/或時間點如何，研究參與者中任何特定腸道微生物的存在和/或相對豐度沒有差異。
腸道微生物群的Alpha（α）-多樣性
我們分析了參與者腸道微生物組的微生物多樣性（圖2）。 我們發現，在餵食SMB和SMMB四周后，兩組女性腸道微生物組的物種豐富度（Chao1指數，p=0.09）沒有顯著差異，儘管第1佇列的Chao1指數相對較高。 在研究期間，兩組之間的物種豐富度差異保持不顯著（p>0.01）。 同樣，在餵食四周后，SMB和SMMB之間的物種均勻度（Shannon多樣性）和已識別物種的相對豐度（Simpson指數）相當（p>0.01）。 餵食八周后，兩組之間腸道微生物的相對豐度和/或均勻度沒有差異。 儘管SMB餵食佇列中腸道微生物的相對豐度有輕微增加，但與SMMB佇列相比，總體豐度仍然不顯著（p>0.01）。 此外，在餵食后四周，兩組之間在物種均勻度和/或相對豐度方面沒有觀察到顯著差異（p>0.01）。
最豐富腸道微生物的描述
除了評估整體微生物多樣性外，我們還分析了所有組和時間點中20種最豐富的細菌物種。 我們在合併數據集中確定了前20種細菌物種，並按其相對豐度排序，如下所示（表2）。 這些按豐度遞減順序排列為：普拉梭菌、Enoeca普雷沃菌、Jejuni普雷沃菌、直腸真桿菌、Eligens真桿菌、脆弱擬桿菌、Ruminicola普雷沃菌、Valericigenes顫菌、Champanellensis瘤胃球菌、Phocaeense梭菌、Dentalis普雷沃菌、Aerofaciens柯林斯菌、Blautiasp. N6H1-15、Hadus厭氧孢桿菌、Hallii真桿菌、Marseille-P5638戴阿利斯特菌、Hominis羅斯伯里菌、Helcogenes擬桿菌、Pectinilyticus單桿菌、Bicirculans瘤胃球菌。 如熱圖所示（圖3），這些物種的相對豐度在餵食前、餵食期間和餵食后四周在各組之間有所變化。
我們搜索了現有文獻，瞭解從分析中識別出的二十種最豐富細菌對腸道健康的潛在影響（表2），並確定了13種有益細菌（普拉梭菌、Eligens真桿菌、脆弱擬桿菌、Ruminicola普雷沃菌、Champanellensis瘤胃球菌、Phocaeense梭菌、Blautiasp. N6H1-15、Hadus厭氧孢桿菌、Hallii真桿菌、Marseille-P5638戴阿利斯特菌、Hominis羅斯伯里菌、Helcogenes擬桿菌、Bicirculans瘤胃球菌）和七種有害細菌（Enoeca普雷沃菌、Jejuni普雷沃菌、直腸真桿菌、Valericigenes顫菌、Dentalis普雷沃菌、 Aerofaciens柯林斯菌、Pectinilyticus單球菌）。
使用每種一個例子來評估食用SMB與SMMB對腸道健康的潛在影響，我們發現食用SMB顯著（p<0.0001）降低了腸道中直腸真桿菌（與結腸癌相關）的比值比（OR），從1.15降至0.88（表3）。 相比之下，儘管SMB在餵食前對普拉梭菌（腸道丁酸生產者）攜帶的OR高於SMMB（OR=1.07,95% CI=1.06-1.08，p<0.0001），但在干預期間后，攜帶情況沒有顯著差異（OR=0.99,95% CI=0.99-1.01，p=0.5375）。
有益和有害腸道微生物的分佈
在餵食干預前，SMB和SMMB的已識別有益腸道微生物的總相對豐度分別為31.69%和31.52%（圖4）。 餵食八周后，這些有益微生物的豐度顯著（p=0.0001）增加，SMB和SMMB分別達到21.15%和21.31%。 餵食終止四周后，SMB的這些有益微生物比例顯著（p<0.0001）降低至30.14%，但在SMMB中保持較高，為32.40%。 相比之下，SMB中有害腸道微生物的比例在餵食干預前為32.72%，餵食四周后降至32.31%，八周時進一步輕微降至32.26%，干預后四周豐度急劇增加至34.27%（圖4）。 SMMB中也有類似趨勢，干預前為32.89%，餵食四周時達到峰值33.31%，餵食八周時顯著（p<0.0001）降低至32.00%，餵食后四周保持恆定（32.01%）。
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