背景
系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種與全身炎症和多器官受累相關的自身免疫性疾病。 新興證據表明，腸道菌群失調可能與其免疫病理發生有關。
目標
本研究旨在表徵韓國SLE患者的腸道微生物組成和多樣性，並評估其與臨床特徵的關聯。
方法
使用16S rRNA基因測序分析了157名SLE患者和50名健康對照者（HC）的糞便樣本。 評估了α和β多樣性指標，並分析了分類學差異。 根據狼瘡性腎炎（LN）狀態和疾病活動度進行了亞組比較。 使用PICRUSt2推斷功能預測。
結果
SLE患者表現出顯著降低的微生
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物豐富度（Chao1、ACE、Fisher指數），而均勻度（Shannon、Simpson）保持不變。 β多樣性分析顯示SLE組和HC組之間存在明顯聚類。 SLE的特徵是擬桿菌屬、鏈球菌屬和韋榮球菌屬富集，而柯林斯菌屬、瘤胃球菌屬和雙歧桿菌屬減少。 LEfSe分析識別出幾種具有區分性的分類群。 然而，在LN陽性組與LN陰性組之間或高疾病活動度組與低疾病活動度組之間未觀察到顯著的微生物差異。 功能預測顯示各組間微生物通路差異微小。
結論
這些發現突顯了韓國SLE患者獨特的腸道微生物改變，並支援微生物組特徵作為診斷生物標誌物或治療靶點的潛在效用。
引言
系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種慢性全身性自身免疫性疾病，其特徵是產生多種自身抗體和免疫複合物，導致多個器官系統的炎症和損傷。 SLE的臨床異質性，從輕度皮膚受累到危及生命的腎臟、神經或心血管表現，反映了其潛在免疫病理發生的複雜性[1]。 儘管遺傳易感性是SLE中已確立的因素，但同卵雙胞胎的一致率仍低於60%，這強調了環境因素在疾病發展和進展中的關鍵作用[2]。
在這些環境影響因素中，腸道微生物群最近已成為包括SLE在內的自身免疫疾病的關鍵貢獻者[3， 4]。 人類腸道微生物組由數萬億微生物組成，參與代謝、免疫和保護功能。 失調，定義為微生物群落結構和功能的不平衡，已與一系列慢性疾病相關，如炎症性腸病、類風濕關節炎和1型糖尿病[5]。 在SLE中，來自動物和人類研究的累積證據表明，腸道失調不僅可能反映疾病活動，還可能積極驅動自身免疫[3， 6]。 早期研究表明，SLE患者的腸道微生物中α多樣性持續降低，擬桿菌門與厚壁菌門的比例發生改變[6， 7]。 某些細菌類群，如瘤胃球菌屬、埃格特菌屬和普雷沃菌屬，已被反覆確定為在SLE中擴增，並與疾病活動度增加、腎臟受累和全身炎症相關聯[3， 6， 8]。 從機制上講，這些致病菌被認為會損害腸道上皮屏障完整性，允許微生物產物轉位，通過分子類比和抗原刺激啟動自身反應性T細胞和B細胞[3， 6]。
巨集基因組和代謝組學方法的最新進展進一步強調了微生物衍生代謝物與宿主免疫之間的相互作用。 短鏈脂肪酸（SCFA）等微生物發酵產物影響調節性T細胞分化和黏膜耐受，而細菌內毒素可啟動模式識別受體如TLR4和NLRs，促進全身炎症[5]。 Chen等人的研究表明，SLE富集的微生物物種可以產生類比宿主自身抗原的促炎肽，即使在沒有明顯感染的情況下也能誘導全身免疫啟動[3]。 儘管在中國、西班牙、法國和美國等不同人群的橫斷面病例對照研究一致報告了SLE中的腸道微生物改變，但佇列間存在差異，可能受種族、飲食、地理和治療狀態的影響[4， 6， 7]。 此外，這些微生物改變的臨床相關性，特別是其與器官特異性受累（如狼瘡性腎炎）或疾病活動度的關聯，仍不確定[3， 4]。
在本研究中，我們旨在使用16S rRNA基因測序全面表徵157名韓國SLE患者的腸道微生物群，並與50名健康對照者（HC）比較微生物多樣性和組成的差異。 此外，我們調查了SLE佇列中腸道微生物群譜是否根據LN狀態或疾病活動度水準而有所不同。 我們的發現為SLE相關失調的日益增多的文獻做出了貢獻，並提供了對其人群特異性特徵及其作為診斷或治療生物標誌物潛力的見解。
材料與方法
研究人群和樣本收集
本研究包括157名根據2019年歐洲抗風濕病聯盟/美國風濕病學會（ACR）分類標準診斷為SLE的患者[9]。 患者前瞻性地從韓國首爾聖瑪麗醫院和汝矣島聖瑪麗醫院招募。 招募了50名年齡和性別匹配的健康個體作為HC，這些健康個體沒有自身免疫或胃腸道疾病史，且近3個月內未使用抗生素。 在樣本收集時記錄了人口統計學和臨床數據，包括年齡、性別、病程、用藥情況、LN的存在以及系統性狼瘡國際合作臨床/ACR損傷指數和SLE疾病活動指數（SLEDAI）評分等臨床參數[10， 11]。 使用標準化問卷收集飲食和生活方式資訊（吸煙狀況和數量、咖啡和酒精消費）。 然而，由於在糞便採樣前未施加飲食限制，且問卷結果主要是描述性的，這些數據未作為協變數納入分析。 收集了所有SLE患者的藥物資訊，包括糖皮質激素、羥氯喹、胃腸道藥物和貝利尤單抗。 使用無菌容器從參與者處獲取新鮮糞便樣本，並立即儲存在-80°C直至喚醒慾望女士催情 一夜傾心迷幻藥 再次悸動治療性冷感 堅持到底男士持久 快速起效男士助勃 掌控時間延時噴霧 淫蕩春藥水 自然加碼陰莖增大 草本配方補腎壯陽 點燃欲火男士催情DNA提取。
DNA提取、PCR擴增和測序
使用Maxwell® RSC PureFood GMO和Authentication試劑盒（Promega， Madison， WI， USA）按照製造商的方案提取基因組DNA。 所有樣本均使用相同的提取方案進行處理。 糞便樣本以小批量順序提交，並以隨機和盲法方式進行提取和測序，確保樣本處理順序與疾病狀態無關。 對於細菌譜型分析，使用融合引物341F（5』-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）和805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）擴增16S rRNA基因的V3-V4高變區。 融合引物包括用於多重分析的Nextera接頭和唯一條碼。 PCR擴增條件如下：95°C 3分鐘，隨後進行25個迴圈（95°C 30秒、55°C 30秒、72°C 30秒），最後在72°C延伸5分鐘。 通過1%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物，使用磁珠純化，並以等摩爾濃度彙集。 使用ProNex®尺寸選擇性純化系統（Promega）去除短片段。 在CJ Bioscience， Inc.（韓國首爾）使用Illumina MiSeq平臺（2 × 300 bp配對末端）進行測序。 本研究未包括陰性對照（提取空白和PCR空白）和陽性對照（類比群落）。 所有實驗室步驟均按照標準化CJ Bioscience工作流程在無菌、污染控制條件下進行。
序列處理和分類分配
使用Cutadapt（v3.2）進行初始質量過濾以去除適配器和引物序列[12]。 使用DADA2 R包（v1.20.0）中的filterAndTrim函數，在第一個鹼基品質分數≤Q20處截斷讀段[13]。 使用mergePairs合併正向和反向讀段，並使用removeBimeraDenovo去除嵌合序列。 使用QIIME2（v2021.11）中的DADA2外掛程式推斷擴增子序列變體（ASV）表[14]，該外掛程式在自動排除虛假單例讀段的同時執行去噪、糾錯和嵌合體去除。 因此，單例ASV自動被排除，無需額外的單例過濾。 除了標準DADA2流程外，未應用額外的去污染步驟或手動去除ASV。 QIIME2-DADA2流程中每一步的樣本測序統計數據總結在補充表S1中。 每個樣本的平均原始測序深度約為82,500條配對末端讀段，在質量過濾和嵌合體去除后，每個樣本的中位最終讀段深度為38,262條（IQR 16,304;範圍17,173–81,417）。 由於測序深度低而排除了任何樣本，所有糞便樣本均納入下游分析。 使用QIIME2外掛程式q2-feature-classifier classify-consensus-vsearch針對EzBioCloud 16S rRNA基因資料庫（v4.1,2022年11月18日）進行分類分配[15]。 以≥97%序列同一性和≥80%覆蓋度識別分類群。 由於V3-V4 16S區域並不總是提供足夠的解析度來區分密切相關物種，因此物種水平的鑒定被視為推定的。
微生物組分析
所有下游微生物組分析均使用R軟體（v4.2.0）進行。 “phyloseq” R包（v1.50.0）用於數據預處理、分類聚合和多樣性分析[16]。 使用*vegan：rarecurve（）*函數生成稀有化曲線（測序深度vs觀察到的ASV），以評估樣本間的測序深度。 如補充圖S1所示，所有樣本均達到清晰的平臺期，表明測序覆蓋充分。 由於所有樣本均超過飽和點（最終中位深度≈38,000條讀段/樣本），未應用基於稀有化的亞採樣截止值。 相反，使用相對於每個樣本總讀段的相對豐度歸一化進行多樣性和差異豐度分析，以最小化不均勻測序深度造成的偏差。 使用QIIME2 DADA2外掛程式計算α多樣性指數（包括Chao1[17]、Shannon和Simpson[18]），並使用Wilcoxon秩和檢驗比較組間差異[19]。 通過計算Bray-Curtis差異並使用主座標分析（PCoA）進行可視化來評估β多樣性。 使用“vegan” R包（v2.6-10）通過999次置換的PERMANOVA檢驗群落結構的組間差異[20， 21]。
生物標誌物發現
為了識別SLE組和HC組之間差異豐度的微生物分類群，使用“microbiomeMarker” R包（v1.13.2）進行線性判別分析效應大小（LEfSe）分析[22， 23]。 Kruskal-Wallis檢驗p值≤0.05和Wilcoxon檢驗p值≤0.05的分類群被視為顯著。 LDA得分閾值在屬水平設為≥2.0，在物種水準設為≥1.0。
臨床相關性分析
使用Spearman秩相關[24]評估關鍵微生物分類群的相對豐度與臨床參數（如疾病活動指數、LN的存在）之間的關聯。 使用“ggplot2”包（v3.3.5）的自定義R腳本將相關矩陣可視化為熱圖[25]。 顯著性水準表示為p < 0.05（*）、p < 0.01（**）和p < 0.001（***）。
批次處理和混雜因素
所有糞便樣本均使用相同的Maxwell RSC PureFood GMO和Authentication試劑盒（Promega）提取，並以隨機和盲法方式處理，以確保樣本順序和測序批次與疾病/對照狀態無關。 鑒於所有SLE患者均接受治療，且在此真實世界臨床佇列中難以進行飲食控制，未進行藥物或飲食的多變數回歸。 然而，進行了包含關鍵臨床協變數的額外相關性分析，並在補充圖S2中展示。
微生物代謝的功能預測
使用在QIIME2（v2021.11）和CJ Bioscience的基於EzBioCloud 16S的MTP分析平臺中實施的PICRUSt2流程（v2.4.1）[26]推斷腸道微生物群的功能譜型。 通過計算每個樣本的最近測序分類單元指數（NSTI）來評估巨集基因組推斷的準確性。 在所有樣本中，平均NSTI為0.021±0.013（中位數0.017，IQR 0.010，範圍[min-max]0.005–0.094），表明大多數ASV與測序參考基因組密切相關，預測的功能譜型高度可靠。 使用KEGG直系同源物（KO）和酶委員會（EC）分類系統註釋預測的功能[27]。 比較SLE組和HC組之間預測通路和酶功能的相對豐度。 通過條形圖可視化功能差異。 使用Welch’s t檢驗進行統計比較，隨後進行Benjamini-Hochberg假發現率（FDR）校正，調整後p值≤0.05的通路被視為顯著。
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