抗菌素耐藥性危機亟需新型治療手段。 硒納米顆粒（SeNPs）展現出良好前景，但其精確的殺菌機制仍未完全闡明。 本研究旨在闡明通過抗壞血酸和檸檬酸鈉綠色方法合成的硠納米顆粒的抗菌作用。 所獲得的硒納米顆粒呈單分散狀態（17.8±0.66 nm），結晶度高且高度穩定（ζ電位：-69.9±4.3 mV），對多重耐葯大腸桿菌表現出強大的殺菌活性。 為生成機制假說，我們將表型分析與初步單次重複蛋白質組學分析相結合。 認識到這是探索性步驟，我們專注於分析變化最顯著的蛋白質。 結果顯示，硒納米顆粒對核心細胞過程實施了有針對性的雙重攻擊，形成連貫模式。 數據表明，硒納米顆粒同時誘導氧化應激，同時嚴重耗竭主要抗氧化谷胱甘肽系統的關鍵組分; 關鍵解毒酶——谷胱甘肽S-轉移酶和谷氧還蛋白2的表達量降低18-19倍，而應激蛋白HchA降低了63倍以上。 同時，數據顯示中心能量代謝受到嚴重破壞; 三羧酸迴圈中的鐵硫酶，包括烏頭酸水合酶（降低8.1倍）和琥珀酸脫氫酶（降低13.9倍）受到嚴重抑制，氧化磷酸化過程受損（如NADH脫氫酶亞基B降低4.7倍）。 我們提出，這種協同破壞形成了致命的反饋迴圈，導致代謝癱瘓。 因此，本研究為硒納米顆粒的作用提供了詳細且可驗證的機制假說，使其成為對抗耐葯病原體的強效多靶點抗菌策略的候選方案。
關鍵詞：硒納米顆粒; 多重耐葯; 抗菌活性; 蛋白質組學分析; 谷胱甘肽系統
1. 引言
抗菌素耐藥性（AMR）是指感染性微生物（細菌、病毒、真菌和寄生蟲）對抗菌劑的敏感性降低的狀況。 由此導致的藥物耐藥性使標準治療方案失效，使感染越來越難以治療。 治療失敗增加了疾病廣泛傳播、嚴重疾病和患者死亡的可能性。
AMR的產生源於微生物的自然遺傳適應。 然而，其快速出現和傳播的主要驅動因素是人類活動。 在臨床、獸醫和農業環境中廣泛且常常不適當使用抗菌劑所產生的選擇壓力是最重要的加速因素。 在此背景下，無機納米顆粒因其能夠通過與傳統抗生素不同的物理和生化機制靶向細菌，可能克服現有耐葯途徑，已成為有前途的替代品。 其中，硒納米顆粒（SeNPs）因其與無機硒和其他金屬基納米顆粒相比具有高生物相容性和低毒性，以及其已證明的廣譜生物活性而受到廣泛關注。
硒納米顆粒（SeNPs）相比其他形式的硒具有顯著優勢，使其在生物醫學應用中極具吸引力。 與亞硒酸鹽和硒酸鹽等無機硒鹽相比，SeNPs表現出明顯更低的毒性特徵，擴大了這種必需微量元素的安全治療視窗。 其納米級尺寸有助於提高生物利用度和更高的生物活性，增強其吸收和功效。 這些納米顆粒以其生物相容性和多功能性著稱，其表面可以輕鬆修飾或與各種生物分子（如蛋白質或多糖）結合，以提高穩定性、靶向性和特定治療效果。 硒納米顆粒（SeNPs）表現出作為抗癌劑和抗氧化劑的顯著雙重功能，具體結果在很大程度上取決於生物環境和細胞氧化還原環境。 這種雙重行為是其治療吸引力的核心。 SeNPs一個特別有前景的應用是其對多種病原體（包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，以及白色念珠菌等真菌）具有強效且多方面的抗菌活性。 其功效高度依賴於理化特性，研究表明控制顆粒大小對於最大化抗菌效果至關重要; 例如，直徑約81 nm的SeNPs被發現對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的抑制效果最佳。
然而，SeNPs的抗菌功效高度依賴於其理化特性，如尺寸、結晶度和表面化學性質，而這些特性又由合成方法決定。 許多傳統化學合成涉及苛刻的還原劑和穩定劑，引發了對殘留毒性和環境影響的擔憂。 因此，開發使用無毒試劑生產定義明確的SeNPs的綠色或環境友好型合成方法是其安全生物醫學應用的關鍵步驟。 為此，本研究採用抗壞血酸（維生素C）作為還原劑和檸檬酸鈉作為穩定劑的合成策略。 抗壞血酸是一種生物相容性強且有效的還原劑，非常適合在不引入有毒副產物的情況下生成SeNPs。 同樣，檸檬酸及其鹽作為有效的封端劑控制顆粒生長並防止聚集，確保膠體穩定性並增強生物相容性。
儘管關於SeNPs抗菌特性的文獻越來越多，但要瞭解其對細菌細胞在分子水準上的精確作用機制，仍需更多知識。 許多研究描述了表型結果，如生長抑制和膜損傷，但隨後的細胞內事件和細菌細胞的全域代謝反應仍未得到充分表徵。 這種機制深度的缺乏阻礙了將SeNPs作為有效抗菌劑的合理設計和應用。
為解決這一差距，我們採用初步蛋白質組學分析來制定針對我們的抗壞血酸/檸檬酸合成的SeNPs對MDR細菌的細胞毒性效應的具體、可驗證的機制假說。 定量蛋白質組學提供了強大的、無偏見的工具，可繪製回應應激的整個蛋白質表達變化圖譜，揭示被靶向的特定細胞通路和過程。 本研究旨在使用涉及抗壞血酸和檸檬酸鈉還原亞硒酸鈉的簡單綠色合成方法製備硒納米顆粒（SeNPs）。 主要目標是評估這些SeNPs對多重耐葯細菌的抗菌功效，並採用初步探索性蛋白質組學方法識別連貫的分子模式。 所得數據用於生成關於抗菌機制的可驗證假說，為未來開發針對MDR病原體的SeNP-based療法提供基礎框架。
2. 材料與方法
2.1 微生物
測試病原體銅綠假單胞菌（ATCC27853）、金黃色葡萄球菌（ATCC12600）、大腸桿菌（ATCC13706）、肺炎克雷伯菌（ATCC43816）和大腸桿菌（ATCC25922）來自美國典型培養物保藏中心（ATCC，美國羅克維爾）。 而多重耐藥尿路感染病原體腸球菌N2023和大腸桿菌Mar002由埃及曼蘇拉大學微生物學實驗室提供。 為準備每種微生物的過夜培養物，將一菌落懸浮於LB肉湯（Thermo Fisher，美國沃爾瑟姆）中，在37°C下以200 rpm振蕩培養。
2.2 多重耐藥尿路感染病原體的分子鑒定
使用通用細菌引物27F（AGRGTTYGATYMTGGCTCAG）和1492R（RGYTACCTTGTTACGACTT）通過聚合酶鏈式反應（PCR）擴增DNA，靶向16S rRNA基因。 PCR使用TransStart Fastpfu DNA聚合酶系統（TransGen Biotech，北京）在50 μL反應體積中進行，包含10 μL 5× FastPfu緩衝液、2 μL 2.5 mM dNTPs、各1 μL正向和反向引物（5 μM）、0.5 μL FastPfu聚合酶，以及約10 ng範本DNA，剩餘體積用ddH2O補足。 擴增在ABI GeneAmp® 9700 PCR儀器上進行，細菌的熱循環參數如下：95°C初始變性5分鐘，隨後27個迴圈（95°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸45秒），最後72°C延伸10分鐘，然後在10°C保持。 所得PCR產物經純化並使用3730XL DNA分析儀測序。 將獲得的序列與參考資料庫使用NCBI BLAST演算法進行比對，其中關鍵參數如最大得分、總得分、查詢覆蓋率和E值被解釋以分配分類學身份，高分和覆蓋率以及低E值表明可靠匹配。 系統發育分析使用MEGA 12軟體通過鄰接法進行樹構建。 進化距離使用p距離法計算。 應用完全刪除選項以消除包含缺口和缺失數據的位置。 系統發育樹使用ITOL伺服器進行可視化。
2.3 硒納米顆粒（SeNPs）合成
使用抗壞血酸（AA）作為還原劑和1 mM檸檬酸鈉（pH 7.5）作為穩定劑製備硒納米顆粒（SeNPs）。 將10 mL亞硒酸鈉（Na2SeO3）（1 mM）加入反應混合物中，該混合物由100 mL pH調至7.5的1 mM檸檬酸鈉組成。 然後，將30 mL抗壞血酸（4 mM）逐滴加入反應混合物中，持續以70 rpm攪拌。 顏色逐漸變為深紅色。 用鋁箔覆蓋燒瓶並攪拌3小時，然後在30°C和200 rpm下孵育24小時以完成Na2SeO3的還原。 通過顏色變為紅色視覺監測SeNP形成，並通過紫外-可見光譜確認。 通過在12,000 rpm下離心20分鐘收集納米顆粒。 沉澱用雙蒸餾水洗滌兩次以去除雜質。 然後將純化的硒納米顆粒凍乾並儲存在密閉、避光的容器中，以防止氧化和降解，直到進一步表徵。
2.4 納硒顆粒的表徵
- 透射電子顯微鏡
將SeNPs懸浮液一滴置於碳塗層銅網上（CCG），並通過讓水在室溫下蒸發使其乾燥。 使用JEOL JEM-1010透射電子顯微鏡（日本東京）在80 kV下獲取電子顯微照片，該設備位於Al-Azhar大學區域真菌學和生物技術中心。
- ζ電位估計
製備1 mg/mL的SeNPs儲備濃度。 隨後將該儲備溶液稀釋100倍以準備分析。 為確保分散並破壞任何聚集體，將稀釋樣品超聲處理5分鐘。 然後使用Zetasizer Nano ZN儀器（Malvern Panalytical Ltd.，英國瑪律文）通過動態光散射（DLS）定量評估ζ電位。 所有測量均在固定散射角173°和保持在25°C的溫度下進行，每個樣品分析三次以確保統計可靠性。
- X射線衍射（XRD）分析
使用Bruker D2 Phaser 2nd Gen衍射儀（美國馬薩諸塞州比勒里卡）對硒納
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米顆粒的晶體結構和相進行識別，該設備配備銅X射線管陽極（工作在30 kV和10 mA）和單色器。 使用Cu Kα輻射（波長：α1 = 1.54060 Å，α2 = 1.54439 Å）。 將粉末樣品載入到標準樣品架上並以15 rpm旋轉。 數據在Bragg-Brentano幾何結構下收集，2θ範圍為10°至70°，步長為0.04°，每步停留時間為132秒。 發散縫和接收縫分別設置為1.00和2.5 mm。 分析在23.5°C的環境溫度下進行。
2.5 納硒顆粒的抗菌活性
使用紙片擴散法根據CLSI指南評估合成的硒納米顆粒（SeNPs）對一組人類病原體的抗菌功效。 通過在Mueller-Hinton瓊脂平板上塗抹測試生物體（5×10^5 cfu/mL）製備細菌草坪。 將SeNPs懸浮液（15 μg）的等分試樣（10 μL）應用於無菌5 mm濾紙片。 乾燥后，將紙片無菌轉移到接種瓊脂表面。 對於陰性對照，紙片浸有10 μL pH 7.5的0.1 mM檸檬酸鈉溶液。 隨後將所有平板在37°C下孵育24小時。 孵育后，測量抑制區的直徑。 每種條件進行三次測定，數據表示為具有相應標準偏差的平均值。 使用卡那黴素作為陽性對照。
2.6 SeNPs對不同病原微生物的MIC和MBC測定
使用Mueller-Hinton肉湯通過微量肉湯稀釋法測定硒納米顆粒懸浮液的最小抑菌濃度（MIC）。 簡而言之，將Mueller-Hinton瓊脂上生長的過夜培養物調整至約5×10^5菌落形成單位（CFU）每毫升Mueller-Hinton肉湯。 在96孔微量滴定板中，將50 μL該細菌溶液與50 μL雙倍濃度的SeNPs膠體（600 μg/mL至0.586 μg/mL）混合。 將平板在37°C下孵育20±2小時。 將無濁度的最低SeNPs濃度視為MIC值。 通過將0.01 mL等分試樣從巨集觀上澄清的孔中亞培養到無菌營養瓊脂中24小時，在37°C下測定MBC。 MBC被定義為在MHA上未觀察到細菌菌落的最低SeNPs濃度。 計算MBC/MIC比值以確定SeNPs對細菌病原體的殺菌或抑菌特性。 使用卡那黴素作為陽性對照。
2.7 使用透射電子顯微鏡製備和檢查細菌
使用大腸桿菌Mar002菌株作為模型病原體來評估SeNPs的細胞毒性效應。 用10 μg/mL SeNPs處理的細菌樣品用於透射電子顯微鏡（TEM）成像，並將其形態變化與未處理的對照細胞進行比較。 為準備樣品，將24小時營養肉湯中培養的細菌細胞在4000 rpm下離心10分鐘收集，隨後用蒸餾水洗滌。 然後將細胞在3%戊二醛中固定，在磷酸鹽緩衝液中沖洗，並在室溫下在高錳酸鉀溶液中后固定5分鐘。 使用乙醇系列（10%至90%）在每個濃度下處理15分鐘進行脫水，隨後用無水乙醇處理30分鐘。 然後通過丙酮和樹脂溶液的梯度系列滲透樣品。 將超薄切片收集到銅網上，並用醋酸鈾醯和檸檬酸鉛雙染色。 在區域真菌學和生物技術中心（RCMB），Al-Azhar大學的透射電子顯微鏡（JEOL JEM-1010，日本東京）在80 kV下檢查切片。
2.8 蛋白質組學分析
使用大腸桿菌Mar002樣品，對照或用10 μg/mL SeNPs處理，進行蛋白質組學分析以瞭解SeNPs對蛋白表達的細胞毒性。 通過向細菌沉澱樣品中加入200 μL 8 M尿素緩衝液（500 mM Tris，pH 8.5）進行蛋白質提取，隨後使用超聲勻漿器進行勻漿。 然後將勻漿劇烈振蕩並在4°C下以10,000 RPM離心30分鐘。 使用deNovix DS-11 FX系列儀器上的Bradford分析定量所得蛋白質上清液。
對於消化，將每個樣品中的30 μg總蛋白質用2 μL 200 mM二硫蘇糖醇（DTT）在室溫下還原45分鐘，隨後用2 μL 1 M碘乙醯胺（IAA）在黑暗中烷基化45分鐘。 用102 μL 100 mM Tris（pH 8.5）調整體積，然後通過加入6 μL胰蛋白酶（1 μg豬酶）並以900 rpm在37°C下過夜孵育來啟動胰蛋白酶消化。 通過用6 μL 100%甲酸將樣品酸化至pH 2-3來停止消化。
使用MonoSpin反相柱（Stage Tip）純化和脫鹽肽。 用50 μL甲醇活化柱，用50 μL溶液B（0.2%甲酸，80%乙腈）初始化，並用50 μL溶液A（0.2%甲酸）重新平衡兩次。 將酸化消化物載入到柱上，用50 μL溶液A洗滌兩次，並用三個50 μL溶液B等分試樣洗脫肽。 使用速干儀濃縮洗脫液，並在20 μL溶液A中重新懸浮。 使用deNovix DS-11 FX儀器上的二喹啉甲酸（BCA）分析測定肽濃度。
對於液相色譜-質譜（LC-MS/MS）分析，將1 μg肽（在10 μL中）注入Eksigent nanoLC 400系統，該系統與Sciex TripleTOF™ 5600+質譜儀（美國馬薩諸塞州弗雷明漢）聯用。 肽在CHROMXP C18-CL柱（5 μm，10×0.5 mm）上捕獲，並在ChromXP C18-CL柱（3 μm，120 Å，150×0.3 mm）上分離，使用57分鐘梯度從3%到80%流動相B（0.1%甲酸在乙腈中），流速為5 μL/min。 數據在正離子模式下採集，TOF質量範圍為400-1250 m/z。 依賴信息的採集（IDA）由高解析度TOF-MS掃描後跟前40個離子（170-1500 m/z）的產物離子掃描組成，循環時間為1.5秒。
使用Protein Pilot軟體（夜色春藥網官網 夜色春藥網線上網店 夜色春藥熱銷商品推薦 關於夜色春藥網 夜色春藥網獨家資訊 夜色春藥網半價購買 夜色春藥網配送方式 夜色春藥網全部商品版本5.0.1.0）和Paragon演算法處理原始數據檔。 資料庫搜索針對UniProt大腸桿菌資料庫（4612個條目）進行，參數如下：碘乙醯胺烷基化半胱氨酸，胰蛋白酶消化，徹底搜索努力，生物修飾ID焦點，以及啟用假發現率（FDR）分析並進行偏差校正。 通過倍數變化計算，將每個樣品的蛋白質組內容與其他樣品進行比較，以確定差異蛋白表達。 顯著上調蛋白（處理樣品中變化不少於2倍）以及處理特有蛋白用於使用clusterProfiler R包（v. 4.1.2）進行基因富集分析，以從KEGG資料庫檢測潛在上調通路和基因本體術語。 類似地，顯著下調蛋白（對照樣品中變化不少於2倍）加上特有對照樣品蛋白以相同方式富集，以定義潛在下調通路和基因本體術語。