背景
目前治療破裂前交叉韌帶（ACL）的標準方法是ACL重建術（ACLR），即用肌腱移植物替換撕裂的韌帶。 植入的肌腱移植物會經歷一個稱為韌帶化的成熟過程。 然而，通常存在於較弱瘢痕組織中的III型膠原蛋白的合成繼續以較高濃度存在，且天然ACL中不同直徑膠原纖維的異質組成從未恢復。 先前研究表明，培養擴增的前交叉韌帶來源細胞重新接種到肌腱移植物上，有可能增強韌帶化過程。 我們進行了體外和體內研究，評估使用脫細胞肌腱移植物與前交叉韌帶來源細胞及無細胞十字韌帶基質（ACLM）粉末相結合進行ACLR的結果，其中ACLM粉末作為生物支架。 我們假設這種組織工程構建體將增強ACLR后移植物的成熟過程和機械性能。
方法
從接受ACLR手術且在受傷后4周內的患者ACL殘餘組織中獲取並分離前交叉韌帶來源細胞。 從人體ACL和後交叉韌帶組織製備ACLM。 將45隻Sprague Dawley大鼠隨機分為3組：標準同種異體移植物組、僅ACLM粉末注射組以及前交叉韌帶來源細胞和ACLM粉末聯合注射組（即目標組）。 將前交叉韌帶來源細胞與ACLM粉末混合，然後在ACLR前注射到脫細胞肌腱移植物中。
結果
體外實驗發現，將ACLM粉末與前交叉韌帶來源細胞結合可改善細胞在肌腱細胞外基質中的存活和整合，從而成功移植前交叉韌帶來源細胞。 動物ACLR實驗通過組織學證實，在重新接種了前交叉韌帶來源細胞和ACLM粉末的移植物中，細胞數量、化生和膠原波紋恢復方面的結構成熟度得到改善。 與對照組相比，I型膠原的增強基因表達導致肌腱移植物具有更優越的機械性能。
結論
植入重新接種培養擴增的前交叉韌帶來源細胞和ACLM粉末的肌腱移植物，增強了肌腱移植物的成熟過程和機械性能。 我們提供了體外和體內概念驗證證據，支援將前交叉韌帶來源細胞與ACLM粉末作為生物支架重新接種到肌腱移植物上用於ACL重建的有效性。
圖形摘要
背景
由於破裂的滑膜鞘和破裂韌帶與關節內滑液的直接接觸，破裂前交叉韌帶（ACL）的自發癒合通常失敗。 目前治療破裂ACL的標準方法是前交叉韌帶重建（ACLR），即用肌腱移植物替換撕裂的韌帶。 自體移植物和同種異體移植物在考慮ACLR的移植物選項時都是可行的選擇。 然而，無論移植物類型如何，植入移植物的機械性能在ACLR手術后都無法恢復正常。 儘管據報導植入的移植物在1年後會經歷重塑，但即使在2年後，完整ACL的機械強度也無法恢復。 動物研究表明，癒合移植物的機械性能（如失效載荷）仍低於天然ACL的50%至60%。 一項檢索髕腱自體移植物的人體病例研究發現，索引手術后18個月，植入移植物的很大一部分持續存在壞死和無細胞現象。
ACLR期間植入的肌腱移植物會經歷一個稱為韌帶化的成熟過程。 據報導，宿主成纖維細胞早期流入移植物的壞死區域，隨後是肌腱移植物的重塑。 然而，通常存在於較弱瘢痕組織中的III型膠原的主要合成繼續以較高濃度存在，且天然ACL中不同直徑膠原纖維的異質組成從未恢復。
為克服這種導致較弱修復性瘢痕組織的耗時癒合過程，已嘗試涉及成纖維細胞或幹細胞移植、基因調控和生物工程的組織工程策略，以增強ACLR結果。 幾項研究表明，破裂的人類ACL組織擁有大量促進癒合和多系分化的細胞。 在最近的一項體外研究中，我們證明將培養擴增的ACL來源細胞重新接種到脫細胞肌腱移植物上，增強了移植物在肌腱細胞外基質（ECM）中存活和整合的能力，與來自脂肪組織的間充質幹細胞相比，可能產生更高的I型膠原基因表達水準，從而可能導致正常的韌帶化過程。 然而，有研究表明，大多數移植的幹細胞由於宿主組織中缺氧、營養不良、炎症和缺乏生物物理保護等嚴酷條件，在植入后1周內死亡。 ECM通過調節細胞-基質相互作用提供影響細胞命運的物理結構，研究已證實組織來源的無細胞基質作為細胞載體或生物支架的有效性。 Xu等人報告稱，在動物模型中將無細胞軟骨基質應用於骨髓幹細胞，通過促進軟骨細胞分化，有效修復了關節軟骨缺陷。 Mao等人發現，應用源自軟骨細胞的無細胞基質促進了原代軟骨細胞的快速擴增並減少了體外去分化。 然而，無細胞十字韌帶基質（ACLM）對ACL來源細胞（特別是在肌腱微環境中的作用）尚未經過測試。 在本研究中，我們進行了體外和體內實驗，評估使用脫細胞肌腱移植物與前交叉韌帶來源細胞結合ACLM粉末作為生物支架進行ACLR的結果。 我們假設這種結合生物支架的幹細胞移植療法將增強移植物的成熟過程並改善ACLR后肌腱移植物的機械性能。
材料和方法
患者
本研究遵循機構指南，並獲得OO醫院倫理委員會批准。 所有患者在參與前提供書面知情同意（IRB-2022-01-049）。 2022年8月至2023年12月期間，從15名（12名男性和3名女性）平均年齡為29.3±2.2歲（範圍為17至41歲）的患者中收集了在受傷后4周內接受初次ACLR的患者ACL殘餘組織中的ACL來源細胞。 ACLM粉末是從2名骨關節炎患者（60歲和62歲）在全膝關節置換術期間收穫的人體ACL和後交叉韌帶（PCL）中提取的。
ACL來源細胞的分離和製備
分離ACL來源細胞和表徵培養擴增的ACL來源細胞的程式此前由Park等人描述。 使用剪刀將ACL殘餘組織解剖成長度<1釐米的片段。 這些組織片段用1×磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）洗滌兩次，並使用I型膠原酶（Gibco， 17100-017; Sigma， C0130）在無血清DMEM中以1毫克/毫升的濃度進行酶消化，補充青黴素-鏈黴素（Thermo Fisher， 15140122），隨後在37°C下搖動孵育3至4小時。 將細胞懸液通過70微米細胞篩檢程式（SPL， 93070）過濾，離心後棄去上清液，從沉澱中分離細胞。 分離的ACL來源細胞培養至第2代，每2至3天更換培養基。 之後，將分離的ACL來源細胞在-80°C深凍保存，隨後儲存在液氮中以長期保存。 所有實驗均使用第3代（P3）的ACL來源細胞。 培養擴增的ACL來源細胞的詳細細胞表徵此前已發表。
ACLM粉末的製備和濃度測定
ACLM是使用基於先前研究的改良方案製備的。 按照無菌程式從供體收集人體ACL和PCL組織。 將收穫的ACL和PCL組織切成<1釐米大小的塊，並在-80°C下冷凍。 將冷凍組織研磨成粗粉，並在1%（w/v）PBS中的十二烷基硫酸鈉溶液中振蕩72小時以促進脫細胞。 樣品在PBS中0.1%（w/v）乙二胺四乙酸溶液中處理24小時，然後在大量去離子水中浸泡過夜以去除殘留化學物質。 徹底洗滌后，將所得ACLM在-80°C下冷凍，並凍干3天以確保完全脫水。 隨後將ACLM研磨成細粉，以便於與細胞混合。 應用低劑量（25 kGy）伽馬輻照（通常用於通過破壞微生物DNA並使病原體失活來有效滅菌）對凍乾的ACLM進行滅菌，並在-20°C下儲存以備後用。
使用先前報導的研究確定接種效率。 簡而言之，將3.75×10^5個ACL來源細胞（第3代）與濃度為10、30和60毫克/毫升的ACLM粉末混合，並注射到每個脫細胞大鼠跟腱移植物中。 孵育24小時后，收集上清液和孔底部的細胞，使用血細胞計數器計數非粘附細胞。 使用公式計算接種效率：接種效率 =（初始細胞數 – 非粘附細胞數）/初始細胞數 × 100%。
移植物製備
對於體外實驗，我們使用了韓國公共組織庫提供的12條捐贈人脫細胞脛骨肌腱同種異體移植物。 所有肌腱同種異體移植物均按照標準方案進行脫細胞和滅菌處理。 最初，肌腱同種異體移植物剝離肌肉組織，並用無菌蒸餾水洗滌5分鐘。 接下來，肌腱移植物用3%過氧化氫處理5分鐘，用70%乙醇處理15分鐘。 所有洗滌程式重複3次。 應用低劑量（25 Gy）伽馬輻照進行滅菌，並將肌腱同種異體移植物在-80°C下冷凍。
對於動物實驗，從成年Sprague Dawley（SD）大鼠（n = 23;年齡 = 10周）中獲取跟腱移植物（n = 46），這些大鼠在犧牲時正用於其他非肌肉骨骼實驗。 通過在跟腱處做側皮膚切口獲取肌腱移植物，並在跟骨插入區域橫向切斷肌腱。 修剪相鄰組織后，在近端橫向切斷肌腱以獲得整個跟腱移植物。 所有移植物立即用無菌紗布包裹，並儲存在-80°C冷凍器中以備後用。
體外實驗
體外實驗隨機分為3組進行：標準同種異體移植物組、僅ACL來源細胞注射組和ACL來源細胞與ACLM粉末聯合注射（目標）組。 人脛骨同種異體移植物在室溫下解凍15分鐘，並切成1.5釐米長的片段。 每個目標組使用來自同一供體的組織以保持一致性。 在目標組中，將1×10^6個ACL來源細胞（P3）與ACLM粉末混合製成150微升細胞懸液，然後使用25號針頭注射到肌腱片段中。 對於對照組，將150微升PBS或ACL來源細胞的懸液注射到肌腱移植物中，不與ACLM粉末混合。 在移植物核心進行單次注射，並仔細監測是否有洩漏。 注射后，將重新接種的肌腱片段在5% CO2環境中孵育20分鐘。 然後將片段轉移到補充了10%胎牛血清和1%青黴素-鏈黴素的高糖DMEM（SH30243.01， Hyclone， USA）中。 每3天更換一次DMEM生長培養基。 在指定的收穫日（接種后1、7和14天），將肌腱片段完全嵌入Tissue-Tek最佳切割溫度（OCT）包埋劑（4583， Sakura， Japan）中，並在-80°C下儲存。 將冷凍組織塊縱向切片成6微米厚。 這些切片用於組織學和免疫組織化學分析，並儲存在-80°C深凍冰箱中的玻璃載片上。
體內ACL重建
OO的動物實驗倫理委員會審查並批准了大鼠方案（2023–0095 A）。 SD大鼠從KOATECH（韓國平澤）獲得。 僅選擇無特定病原體的動物，並在實驗前的適應期內排除任何異常或瀕死動物。 45隻10周齡的骨骼成熟雄性SD大鼠在手術時隨機分為3組（每組n = 15隻大鼠）（圖5A）：標準同種異體移植物組、僅ACLM粉末注射組和ACL來源細胞與ACLM粉末聯合注射組。 目標組和對照組的樣本量基於先前與ACL重建相關的研究確定。 實驗前在室溫下將冷凍大鼠跟腱移植物解凍15分鐘。 大鼠跟腱移植物的平均長度為12.8（±0.554）毫米，平均直徑為1.71（±0.018）毫米。 測試移植物以確定適當的注射體積，使用15微升PBS溶液未觀察到洩漏（補充圖1A）。 基於接種效率實驗，將3.75×10^5個ACL來源細胞（P3）與ACLM粉末（30毫克/毫升）混合，並加入DMEM使總懸浮液體積達到15微升。 使用31號、0.3毫升胰島素針頭（BD， 328822）進行移植物注射，並將樣品在5% CO2培養箱中孵育。
使用異氟醚吸入（Med-Vet International， RXISO-100）麻醉SD大鼠。 去除左後腿的毛髮后，用乙醇和聚維酮碘溶液對皮膚進行消毒。 在膝關節前內側做一個2釐米長的皮膚切口，並將髕骨向外側脫位以暴露關節。 用鋒利的手術刀完全切斷ACL。 使用先前準備的跟腱移植物複合物進行ACL重建。 在股骨和脛骨中創建骨隧道（2.0毫米），並將移植物固定在股骨外側髁或脛骨內側結節上方的骨膜和周圍軟組織上（補充圖1B）。 術后，允許動物自由活動而無任何限制。 動物實驗室保持在22°C的溫度下，具有12小時光照/黑暗週期。 每個籠子飼養3隻大鼠，使用耳標進行識別。 每組15隻大鼠在術后4周（n = 4;僅組織學）或8周（n = 11）實施安樂死。 動物安樂死使用二氧化碳（CO2）。 收穫帶有兩端附著骨骼的天然和重建ACL。 隨後評估以下參數：組織學分析（n = 4）、mRNA分析（n = 3）、力學測試和微CT分析（n = 4）。 組織學分析的樣品在室溫下用10%福馬林固定24小時，用1×PBS洗滌三次，並在室溫下用10%甲酸脫鈣約一周。 隨後，製備石蠟塊。 對進行動物實驗和分析組織病理學的研究人員應用單盲法。 該工作已按照ARRIVE指南2.0報告。
組織學分析
將冷凍切片切至6微米厚度，石蠟切片切至3微米用於組織學分析。 染色程式遵循製造商說明中的標準協定。 蘇木精和伊紅（H&E）染色用於組織學和細胞學評估，而Picrosirius紅（PSR; Abcam， ab150681）用於分析I型和III型膠原。 所有染色載片均使用永久介質（Vector Labs， H-5000）封片。 在200倍放大倍數的明場顯微鏡下觀察肌腱同種異體移植物內的細胞圖像，並跨5張連續載片計數細胞。 所有測量均由2名相互不知情的獨立觀察員分析。
分析移植物細胞數量、壞死和膠原波紋以確定移植物成熟的程度。 細胞數量基於Dong等人描述的主要核形狀。 給出五個等級如下（光學顯微鏡，×200）：0級，圓形核最常見; 1級，梭形核最常見，其次是圓形核; 2級，梭形核最常見，其次是橢圓形核; 3級，梭形核最常見，其次是線性核; 4級，線性核最常見，其次是梭形核。 移植物壞死基於Falconiero等人描述的具有化生（無細胞、無血管和方向不規則的膠原束）的移植物程度。 分配五個等級如下（光學顯微鏡，×200）：0級，無化生; 1級，輕微化生; 2級，局灶性化生區域; 3級，氣泡狀化生區域; 4級，大面積化生。 在偏振光顯微鏡下使用縱向載片的Picrosirius紅染色來評估膠原纖維的組織，根據Zhao等人描述的標準進行分類。 大量波紋的特點是一致的帶狀結構，具有可見的波形。 中度波紋的特點是波形減少，帶狀缺失，膠原纖維部分拉直。 最小波紋涉及大量拉直的膠原纖維區域。
免疫組織化學
如前所述進行免疫組織化學染色。 簡而言之，使用Neo-Clear對載片進行脫蠟，用一系列乙醇溶液（100%至50%乙醇）重新水化，並用蒸餾水和1×PBS洗滌三次。 然後將載片在含有0.3% Triton X-100的1×PBS中孵育10分鐘，隨後在BLOXALL（SP-6000， Vector Lab）中孵育30分鐘。 載片在室溫下用抗體稀釋液（S3022， DAKO， USA）中1：200稀釋的初級抗體孵育1小時，然後用生物素化抗兔免疫球蛋白G次級抗體（BA-1000， Vector Lab）與正常馬血清（S-2012， Vector Lab）混合孵育1小時。 接下來，按照製造商說明將載片與ABC試劑盒組分（PK-6102， Vector Lab）孵育30分鐘，隨後與DAB底物試劑盒（SK-4100， Vector Lab）孵育1至5分鐘。 最後，將載片用蒸餾水洗滌5次，用蘇木精（1.05174.0500， Merck， Germany）復染10秒，通過一系列乙醇溶液（50%至100%乙醇）脫水，並用永久封片介質（H-5000， Vector Lab）封片。 使用Nikon Eclipse Ti-U顯微鏡捕獲染色細胞的圖像。 用於免疫組織化學的抗體為COL1A1（Santa， sc-8784; 稀釋度1：200）和COL3（ABclonal Technology， a3795; 稀釋度1：200）。 使用正常樣品製備陽性和陰性對照。 陽性對照在與實驗樣品相同的染色條件下處理，而陰性對照除了在染色過程中省略初級抗體外，處理方式相同。 使用ImageJ軟體（美國國立衛生研究院）量化免疫組織化學圖像的強度。 選擇感興趣區域（ROI），並測量每個樣品的平均灰度值以評估膠原表達水準。
免疫螢光
在體外實驗中，組織載片在100%冷丙酮中固定10分鐘，隨後用水洗滌10分鐘以去除OCT包埋劑（SAKURA， 4583）。 對於動物實驗，使用Neo-Clear進行脫蠟，用一系列乙醇溶液（100%至50%乙醇）重新水化，並用蒸餾水和1×PBS洗滌三次。 將載片用1×PBS洗滌三次，在含有0.3% Triton X-100的1×PBS中處理10分鐘，並在室溫下用BLOXALL（Vector Lab， SP-6000）封閉30分鐘。 組織載片在4°C下與初級抗體（在抗體稀釋液中稀釋1：100，DAKO， S3022）過夜孵育。 孵育后，將載片用1×PBST洗滌三次，在室溫下與Alexa 488或Cy3偶聯次級抗體（在抗體稀釋液中稀釋至1：100）孵育1小時，並使用含有4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Vectorlabs， H-2000）的介質封片。 使用共聚焦顯微鏡（Leica Microsystems）獲取圖像。 使用的初級抗體為Ki-67（Invitrogen， 14-5698-82）、I型膠原（Santa， sc-8784）或YAP（ABclonal， A1002）。 使用正常樣品製備陽性和陰性對照。 陽性對照在與實驗樣品相同的染色條件下處理，而陰性對照除了在染色過程中省略初級抗體外，處理方式相同。
使用抗人核抗體（Ku-80， Cell Signaling， 2180 S）進行移植後細胞的體內追蹤。 在移植后4周和8周，對Ku-80和I型膠原（Santa， sc-293182）進行共免疫螢光染色，並使用共聚焦顯微鏡獲取圖像。
免疫印跡
使用涉及含有磷酸酶抑製劑（Cell Signaling， 5870 S）和蛋白酶抑製劑（Calbiochem， 535140）的1×RIPA緩衝液的標準程式從ACLM中提取蛋白質。 使用Bradford測定對提取的蛋白質進行定量。 隨後，將2、4和8微克蛋白質用於免疫印跡。 免疫印跡過程中的初級抗體為I型膠原（Santa， sc-8784）。
RT-qPCR
在體外實驗中，使用細胞刮刀刮取組織載片以收集mRNA分析材料。 對於動物實驗，從犧牲的大鼠膝組織中收集重建的肌腱移植物進行mRNA分析。 RNA提取遵循使用TRI試劑的標準程式。 對於定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR）擴增，使用1微克RNA生成互補DNA（cDNA）。 獲得的cDNA用作RT-qPCR的範本。
生物感測器DNA構建體
使用螢光共振能量轉移（FRET，一種通過檢測兩個螢光分子之間距離變化來監測分子相互作用或結構變化的技術）識別生物分子或監測環境變化的Talin-TS（質粒#83376）和Lyn-FAK（質粒#78299）生物感測器從Addgene獲得。 簡而言之，Talin-TS包含一個張力模組，其中容納兩個螢光蛋白，用於測量與整合素β尾部結合的talin頭部結構域和包含肌動蛋白結合位點和vinculin結合位點的桿狀結構域之間的張力。 Talin是一種關鍵的細胞骨架蛋白，將整合素（細胞表面受體）連接到內部肌動蛋白細胞骨架，促進細胞粘附和機械信號傳輸。 當肌動蛋白絲對Talin-TS施加張力時，張力模組內的納米彈簧延伸，增加兩個螢光蛋白之間的距離。 Lyn-FAK生物感測器的核心元件是FAK底物序列，該序列通過柔性連接子與c-Src的SH2結構域緊密連接。 FAK或粘著斑激酶是一種信號蛋白，有助於傳遞涉及細胞運動、附著和存活的機械和化學信號。
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FAK的啟動促使磷酸化底物肽與SH2結構域結合，引發構象變化，導致螢光共振能量轉移減少。 該功能元件與靶向對細胞粘附和周圍環境敏感的去垢劑抗性膜的序列融合。
轉染
轉染前，將ACL來源細胞接種到6孔板（SPL， 30006）上。 使用Lipofectamine 3000（Invitrogen， L3000015）按照製造商指南進行質粒DNA轉染，並將細胞孵育24小時。
FRET圖像採集和計算
使用配備數碼相機（Leica-K5-14401252）和40×/1.30 NA油鏡的Leica DMI8顯微鏡進行涉及Talin-TS和Lyn-FAK生物感測器的FRET比率實驗。 FRET比率計算使用DFT51010濾光立方體（Leica， 11525418）和CYR71010濾光立方體（Leica， 11525416）。 對所有螢光圖像應用背景減除和閃電-雷聲過程，這些圖像使用LAS X軟體捕獲。 基本圖像處理由Fiji（美國國立衛生研究院）進行，並使用LAS X軟體生成偽彩色圖像。 Talin-TS的FRET比率通過將受體圖像除以細胞中的FRET圖像（tagRFP/FRET）來確定。 類似地，Lyn-FAK感測器的FRET比率通過將供體圖像除以FRET圖像（ECFP/FRET）來計算。 FRET比率計算的強度值使用LAS X軟體獲取。 這些計算將talin張力和FAK活性的變化匹配到暖色或冷色。
機械分析
根據報導的研究，在ACLR后8周進行機械分析。 簡而言之，小心去除肌腱移植物周圍的軟組織，並將股骨和脛骨放入3D列印模具（2釐米×2釐米×4釐米）中。 隨後，使用克氏針（SOLCO， 81-61622）固定骨骼，並應用3D列印模具和骨水泥（Heraeus， Palacos R + G）防止骨滑脫（圖7A，B）。 使用材料測試機（TESTONE， TO-101），在0.37毫米/秒的速度下進行5次0.5牛頓的預載載迴圈后，以20毫米/分鐘的伸長率載入至失效，並記錄最終失效載荷。 使用載荷-變形曲線計算剛度。
微CT
使用從先前研究改編的方法，在ACLR手術后8周進行微CT分析。 微CT掃描使用SkyScan 1272微CT設備（Bruker micro-CT， Belgium）垂直於骨隧道長軸設置。 微CT的參數為解析度9.00微米，X射線源電壓60千伏，X射線源電流166微安。 使用CTAn軟體計算股骨和脛骨隧道的平均橫截面積，以評估骨隧道內的新骨生長。 對於骨體積與總體積比（BV/TV），分析直徑為2毫米、高度為3毫米的圓柱形感興趣區域，重點關注脛骨隧道近端和股骨隧道遠端。
統計分析
使用GraphPad Prism 7.0軟體對圖表數據進行定量和統計分析。 使用雙尾配對t檢驗和單向及雙向方差分析比較目標組和對照組在每個時間點的數據。 結果以至少3次獨立實驗的平均值±均值標準誤差（SEM）表示。 星號表示統計顯著性水準（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。
結果
無細胞十字韌帶基質的製備和表徵
凍乾和研磨后，ACLM呈現為細白色粉末（圖1A）。 免疫印跡分析顯示ACLM粉末中I型膠原呈陽性（圖1B）。 測試了3種濃度的ACLM粉末的接種效率，30毫克/毫升組與10和60毫克/毫升組相比表現出顯著（p < 0.001）更高的細胞接種效率（圖1C）。
體外組織學特徵
H&E染色在對照（標準同種異體移植物）組中觀察到的組織學特徵顯示，肌腱同種異體移植物ECM未保留任何細胞。 在第1天，沿肌內束開口處可明顯看到重新接種的細胞簇，即注射ACL來源細胞的位置。 在目標組中，第7天和第14天明顯存在大量整合到肌腱ECM中的伸長細胞; 然而，在僅ACL來源細胞注射組中，第14天幾乎看不到細胞（圖2A）。 當ACLM粉末共同注射時，第7天和第14天后，新的膠原基質似乎在ACL來源細胞周圍形成。 在第14天計數了在肌腱ECM中存活並整合的細胞數量，與僅ACL來源細胞注射組相比，目標組中計數的細胞數量顯著（p < 0.001）更高（圖2B）。 膠原I型和III型的Picrosirius紅染色顯示目標組中與僅ACL來源細胞注射組相比有更多的膠原沉積證據（圖2C）。
體外基質蛋白含量和基因表達
在第14天對Ki-67和I型膠原進行免疫螢光染色，觀察到目標組中Ki-67陽性ACL來源細胞與I型膠原的關聯比僅ACL來源細胞注射組更強（圖2D，E）。 mRNA表達分析證實，與僅ACL來源細胞注射組相比，目標組中I型膠原的基因表達水平顯著（p < 0.01）更高。 然而，兩組之間在III型膠原和其他韌帶相關標誌物（包括tenascin C和smooth muscle A）方面未觀察到顯著差異（圖2F）。
YAP轉位、talin和FAK活性
在第14天對Yes相關蛋白（YAP）進行免疫螢光染色，顯示與僅ACL來源細胞注射組相比，目標組中顯示出YAP向細胞核轉位的細胞數量顯著（p < 0.01）更多（圖3A，B）。 我們使用生物感測器直觀評估ACLM對ACL來源細胞張力再生的影響。 具體來說，使用了兩種生物感測器：talin張力感測器（Talin-TS），它使用粘著斑和肌動蛋白絲檢測張力; 以及Lyn-FAK感測器，它測量對張力增加的粘著斑激酶（FAK）活性變化。 重新接種的ACL來源細胞的螢光強度明顯高於周圍細胞（圖4A）。 與無ACLM相比，共同注射ACLM粉末的ACL來源細胞在talin上表現出顯著（p < 0.001）增加的張力（圖4B）。 此外，轉染Lyn-FAK感測器的ACL來源細
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胞在添加ACLM后表現出FAK活性的顯著（p < 0.05）增加（圖4C，D）。 這些發現強烈表明，添加ACLM粉末增強了ACL來源細胞在肌腱微環境中的粘附。
大鼠ACL重建模型中的組織學特徵
術后4周進行的H&E染色顯示，對照組肌腱移植物記憶體在局灶性（2級）至大面積（4級）的化生區域; 然而，目標組肌腱移植物中發現最小（1級）至無（0級）化生，表明移植物成熟度更高（圖5B）。 術后8周進行的H&E染色顯示，對照組中細胞數量增加，無大面積壞死; 然而，對照組中主要存在梭形（1級）至橢圓形（2級）核的細胞，而目標組中主要存在線性（4級）至梭形（3級）核的細胞，表明目標組中移植物成熟度更高（圖5C）。 術后8周的偏振顯微鏡顯示，與對照組中大量直膠原纖維區域（最小波紋）相比，目標組中具有一致的帶狀結構和可見波形（大量波紋），表明目標組中膠原波紋恢復更好（圖5D）。
大鼠ACL重建模型中的基質蛋白含量和基因表達
進行免疫組織化學分析以評估I型和III型膠原的表達。 與對照組和僅ACLM組相比，術后8周，ACL來源細胞與ACLM組中I型膠原更為突出，顯示出統計學顯著差異（p < 0.001）。 術后8周，與對照組相比，ACL來源細胞與ACLM組中III型膠原的表達顯著（p < 0.05）更高（圖6A）。 術后4周和8周對Ki-67和I型膠原進行免疫螢光染色，顯示與對照組相比，目標組中Ki-67陽性ACL來源細胞中I型膠原的證據更為明顯（圖6B）。 mRNA表達分析證實，與對照組相比，目標組中I型膠原的基因表達顯著（p < 0.05）更高，共同表明與對照組相比，目標組中I型膠原的恢復更優越。 然而，其他韌帶特異性標誌物，包括III型膠原、tenascin C和COMP，未顯示顯著差異（圖6C）。 術后4周和8周對I型膠原和Ku-80（抗人核抗體）進行免疫螢光染色，顯示I型膠原陽性細胞中Ku-80的證據更為明顯，證明在早期成功移植了重新接種的細胞（圖6D）。
機械強度
標準同種異體移植物、僅ACLM粉末注射和目標組的最終失效載荷（N）值分別為13.125±0.431、18.400±0.782和20.400±0.949。 與標準同種異體移植物組相比，僅ACLM粉末注射組（p = 0.002）和目標組（p < 0.001）的失效載荷平均分別增加了40.2%和55.4%（圖7C）。 標準同種異體移植物、僅ACLM粉末注射和目標組的剛度值（N/mm）分別為3.410±0.942、7.918±1.060和9.508±1.020。 與標準同種異體移植物組相比，僅ACLM粉末注射組（p = 0.028）和目標組（p = 0.005）的剛度平均分別增加了132.2%和178.8%（圖7D）。
微CT分析
微CT分析顯示，與標準同種異體移植物組相比，股骨（增加95.3%，p = 0.0219）和脛骨（增加48.4%，p = 0.0113）隧道中形成的新骨平均體積顯著增加（圖8A，B）。 與對照組相比，目標組在脛骨隧道中的骨體積（BV）/總體積（TV）比顯著更高（增加27.6%，p = 0.0152）（圖8C）。
討論
肌腱移植物常用於執行ACLR; 然而，移植物在癒合過程早期會經歷壞死，並通過增殖替代移植物壞死的外來成纖維細胞發生惡化，導致III型膠原過表達。 我們的體外實驗發現，將ACLM粉末與ACL來源細胞結合可改善細胞在肌腱ECM微環境中的存活和整合，從而成功移植ACL來源細胞。 我們的動物ACLR實驗確認了在細胞數量、化生和膠原波紋恢復方面，重新接種了ACL來源細胞和ACLM粉末的移植物的組織學結構成熟度得到改善。 增強的I型膠原基因表達導致肌腱移植物具有更優越的機械性能，支援將自體ACL來源細胞植入作為ACLR的生物增強療法的潛力。
各種細胞類型，包括肌腱細胞、骨髓來源的間充質幹細胞（MSCs）、脂肪來源的MSCs和臍帶來源的MSCs，已測試其再生肌腱的潛力。 Burk等人報告稱，脂肪來源的MSC可以比其他組織來源的MSC更有效地積極影響肌腱基質重組（例如，I型膠原的表達）。 破裂的ACL組織擁有大量具有高擴增和多系分化潛力的細胞。 Park等人報告稱，從急性ACL殘餘組織破裂中可以獲得平均9.5×10^5個原代（CD 34陰性）ACL細胞，並且這些細胞顯示出與脂肪來源MSC相似的實驗室擴增和增殖率。 他們還證明，在肌腱微環境中培養擴增的ACL來源細胞在肌腱ECM中實現了更早和更優越的存活和整合率，與脂肪來源MSC相比，導致更高的I型膠原基因表達。 這支援將ACL來源細胞作為自體幹細胞療法的來源用於增強ACLR后的韌帶化。 然而，破裂ACL組織的狀況可能因個體而異，導致ACL來源細胞的產量不一致。 因此，在臨床環境中應用這種自體組織來源細胞療法可能存在確定理想患者的挑戰。
在ACLR后植入肌腱移植物的癒合過程中，移植物壞死在過程早期發生，導致外來成纖維細胞侵入。 多年來，成纖維細胞增殖形成修復性瘢痕組織; 然而，尚未檢測到移植物成熟的終點。 為克服這種耗時的肌腱再生過程，已在ACLR模型中嘗試將自體成纖維細胞或骨髓來源MSC重新接種到肌腱移植物中。 Lu等人在兔子模型中使用脫細胞同種異體肌腱與骨髓來源間充質幹細胞重新接種進行ACLR。 他們報告了關於成纖維細胞浸潤和血管形成的改進組織學結果。 Ingram等人在異種模型中使用重新接種肌腱細胞的脫細胞肌腱移植物進行ACLR。 他們報告稱，重新接種的肌腱細胞在ECM上可檢測到數周。 他們發現重新接種肌腱ECM具有挑戰性，因為緻密的肌腱ECM不允許足夠的細胞粘附和浸潤。 然而，先前的研究並未評估關於I型膠原合成的韌帶化過程的改進。 在本研究中，ACLM粉末和ACL來源細胞的共同注射改善了細胞在肌腱ECM中的存活和整合，導致成功移植重新接種的細胞和更高的I型膠原基因表達水準。 轉染Lyn-FAK和TalinTS生物感測器的ACL來源細胞顯示，與ACLM粉末結合時活性增加，支援肌腱微環境內的張力誘導細胞粘附機制。 細胞粘附強度通常由整合素與ECM配體的結合調節，這由肌動蛋白-talin耦合和粘著斑介導。 我們的發現指向ACLM的共同注射作為增強talin張力和放大ACL來源細胞內FAK活性的催化劑。 一旦引入肌腱微環境，這些細胞通過粘著斑與ECM建立連接，使其能夠在沒有外部觸發的情況下解釋周圍環境並改變其細胞內生理反應。 細胞通常將來自ECM的機械線索轉化為影響細胞核的信號，並引發導致YAP/TAZ核轉位的化學反應，這在本研究中得到證實。
本研究中的韌帶癒合機制可能與ACL來源細胞的旁分泌作用有關。 ACL來源細胞在體外顯示出多系分化潛力和強烈的韌帶分化傾向。 除了ACL來源細胞的韌帶分化外，移植的ACL來源細胞和宿主細胞之間可能存在未知的旁分泌相互作用，這可能增強了韌帶特異性ECM合成。 在本研究中，移植的細胞在移植后4周逐漸消失，支援重新接種的ACL來源細胞和宿主祖細胞之間的旁分泌相互作用，這可能在韌帶癒合中起重要作用。
我們的努力集中在肌腱移植物的關節內部分的移植物成熟方面。 據報導，動物研究中觀察到的過度移植物壞死在人類ACL移植物中發生在更小的區域。 然而，幾項人類活檢研究證實，在肌腱移植物癒合過程中，移植物壞死（儘管程度較小）、再細胞化、再血管化和膠原組成變化存在類似的重塑級聯。 Janssen等人在他們的67個人類ACL移植物檢索活檢研究中報告稱，肌成纖維細胞和血管密度大幅增加至24個月，確認膠原
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組成和方向在研究期間未恢復正常。 在本研究中，標準肌腱移植物組的4周活檢顯示大面積壞死，8周時細胞數量大幅增加，主要由橢圓形至梭形的不成熟細胞組成。 這與先前報導早期過度移植物壞死，隨後成纖維細胞流入的動物研究一致。 然而，4周活檢中，用ACL來源細胞和ACLM粉末重新接種的移植物中發現最小面積的移植物壞死，8周活檢中主要細胞類型由線性至梭形細胞組成，顯示出更優越的細胞成熟度。 人抗體追蹤分析證實，重新接種的ACL來源細胞在肌腱ECM中成功存活了4周，表明通過移植與ACLM粉末結合的ACL來源細胞可以省略早期移植物壞死階段。
本研究有幾個局限性。 首先，由於不可能將細胞均勻注射到整個肌腱移植物中，結果可能不代表整個移植物組織的發現。 其次，由於ACL供體主要是年輕男性，發現可能不能推廣到所有患者群體。 第三，僅分析了早期時間點（8周內）的結果，我們不能假設完整的韌帶癒合過程在長期內會得到增強。 第四，每個時間點的樣本量較小，研究期相對較短，無法確定癒合移植物的機械性能。 最後，小型動物模型（例如Sprague Dawley大鼠）與人類具有不同的關節生物力學，並且對人源細胞的反應可能在物種間有所不同。 因此，當前實驗的發現不能在韌帶再生的背景下推廣到人類。
結論
據我們所知，這是第一份採用自體ACL來源細胞移植概念的ACLR生物增強療法的報告。 我們提供了體外和體內概念驗證，證明將ACL來源細胞與作為生物支架的ACLM粉末重新接種到肌腱移植物上用於ACL重建在臨床上具有應用前景。 總之，重新接種培養擴增的ACL來源細胞和ACLM粉末的肌腱移植物可以增強移植物成熟過程及其機械性能。
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